La PCR

1. Définition et principe

La PCR (Polymerase Chain Reaction) consiste à amplifier in vitro une partie spécifique du matériel génétique (ADN ou ARN, par exemple d’une babésie) au point de le rendre visible à l’œil. Cette réaction associe donc, dans son principe, une haute sensibilité (capacité à détecter une infime fraction d’une babésie) et haute spécificité (le matériel génétique amplifié étant caractéristique d’une espèce donnée).

2. Matériel

a. Réalisation du prélèvement

La babésie est un protozoaire intra-érythrocytaire strict ; le prélèvement est constitué de sang prélevé chez l’animal suspect et mélangé à un anti-coagulant (EDTA) afin de ne pas piéger les globules rouges dans le caillot.

b. Conservation du prélèvement

Une fois homogénéisé, le tube sang - EDTA peut être conservé à la température du laboratoire. L’hémolyse éventuelle n’altère pas les acides nucléiques du parasite. Le prélèvement peut donc être expédié par la poste, à température ambiante, sous envoi de protection (tube plastique, enveloppe à bulles ou emballage rigide). Pour que l’interprétation soit la plus aisée et la plus juste possible, le prélèvement être identifié et associé à une feuille de commémoratifs complets (contexte clinique et épidémiologique).

3. Méthode

a. Première étape

Extraction des acides nucléiques, soit à l’aide d’un kit spécial (kit QIAGEN®), soit à l’aide de papier-filtre particulier (papier WHATMAN®). Les acides nucléiques ainsi isolés peuvent être conservés très longtemps au laboratoire.

b. Seconde étape

Elle comprend les processus suivants :
- amplification d’une portion de l’ADN babésien grâce à des amorces spécifiques (« primers »)
- dénaturation de l’ADN babésien (séparation des 2 brins par une température élevée)
- fixation des primers sur les parties spécifiques (reconstitution d’un ADN complet à température plus basse)
- dénaturation du nouvel ADN constitué (à haute température)
- nouvelle amplification.
Ce cycle dénaturation -amplification est effectué 35 fois.

c. Troisième étape

Il s’agit de la migration en gel d’agarose de l’ADN obtenu, par comparaison avec un ADN témoin positif (issu par exemple d’une culture de Babesia) et un milieu stérile (témoin négatif).
La même méthode peut être utilisée, dans le cadre d’enquêtes épidémiologiques, sur des broyats de tiques afin de confirmer (ou infirmer) leur rôle vecteur.

4. Résultat et interprétation

L’observation d’une bande située au même niveau que la bande témoin positif signe donc la présence, dans le prélèvement testé, de matériel génétique spécifique. Cela ne préjuge pas pour autant du caractère vivant et infectieux du parasite correspondant : en d’autres termes, un « résultat positif » peut traduire une « babésiose vraie » (multiplication du parasite dans les globules rouges) ou une convalescence (dégradation du parasite par le système immunitaire ou par une thérapeutique spécifique).
La non-observation de bande spécifique observable ou « résultat négatif » traduit l’absence de matériel génétique spécifique dans le prélèvement testé.

Les différents primers et méthodes utilisables permettent de distinguer les diverses espèces de babésies (Babesia canis vs Babesia gibsoni par exemple) et sous-espèces (Babesia canis canis vs Babesia canis vogeli).

Pour en savoir plus :
JEFFERIES R, RYAN UM, MUHLNICKEL C J, IRWIN P J.: Two species of canine Babesia in Australia : detection and characterization by PCR. J. Parasitology, 2003, 89(2), 409-412.

1- échelle de PM
2- mix (ensemble de réactifs servant à la réaction, sans les primers)
3- eau
4- témoin négatif (chien sain)
5- témoin positif (extraction Whatman)
6- témoin positif (extraction Qiagen)
7- prélèvement « positif »
8- prélèvement « négatif »
9- prélèvement « négatif »
10- prélèvement « positif »
11- à 14 prélèvements « négatifs »